实验室老司机独家指南：iPSC细胞培养避坑Q&A

【干货分享】实验室老司机独家指南：iPSC细胞培养避坑Q&A

iPS细胞难培养？？培养基总是结块、复苏后细胞贴不上壁，传代时总出问题？别着急，我们对实验室里几个老司机进行了全面采访，整理了一些实用的小问答，助你轻松避坑，实验更顺畅!

1. iPSC复苏率低怎么办？

复苏率低可能是因为操作不够轻柔，导致细胞受损。常见问题包括吹打力度过大或吹打次数过多，这会把细胞分散成单细胞，从而降低复苏成功率。此外，复苏后的细胞团块大小也很重要。如果团块太小，复苏率可能会受到影响。

要改善复苏率，可以尝试以下措施：
①调整吹打动作：操作时轻柔一点，避免用力过猛。吹打时尽量保持细胞团块在4到10个细胞之间，这样的团块比较稳定，更容易成功复苏。

②减少吹打次数：一次轻柔吹打就够了，不需要反复操作。减少吹打次数能够减少对细胞的机械损伤。

③观察细胞团块大小：复苏后立即用显微镜检查团块是否大小合适。如果发现团块过小，可以在下一次复苏时进一步减少吹打力度和次数，确保细胞聚集成更大的团块。

顺利获得调整这些操作细节，可以显著提高复苏效率。

2. 什么时候传代iPSC细胞最合适？

传传代后细胞贴不上壁，通常是由于消化和重悬过程中操作不当造成的。以下是几种可能的原因以及对应的解决方法：

①细胞消化时间过长，导致消化过度

如果消化时间过长，细胞会失去完整性，变得难以贴附。解决方法是缩短消化时间，并及时观察细胞状态。一旦发现细胞开始轻微变圆，就可以停止消化并进行后续处理。

②消化后吹打次数过多或力度不当

过多的吹打会使细胞团块变得太小，导致贴壁困难。尝试减少吹打次数，同时轻柔操作，避免过度分散细胞。保持细胞团块大小均匀、适中，贴壁的成功率会显著提高。

③消化时间过短，导致细胞被强行吹打下来

消化时间太短，细胞无法顺利脱落，需要依靠强力吹打来分散细胞，这样容易损伤细胞，影响贴壁。解决方法是延长消化时间到适当的长度，让细胞自然脱落，减少机械干扰。

3. 什么时候传代iPSC细胞最合适？

传代的时机直接影响细胞的状态和实验的成功率。通常来说，传代间隔在5天左右比较合适，但也需要根据细胞的实际生长情况灵活调整。如果细胞密度过低，传代太早，贴附率可能较差，细胞数量不足，无法满足实验需求；反之，传代过晚，细胞开始分化，会出现异形细胞，导致实验结果不一致。

理想情况下，在细胞密度较高但未出现分化迹象时传代是最佳选择。观察培养皿中的细胞团块是否饱满且分布均匀，如果大多数细胞团已经接近铺满表面，就可以进行传代了。此外，仔细记录每次传代的时间和细胞生长状况，积累经验后，可以更准确地判断传代时机，保持细胞状态稳定。

4. 培养基里有沉淀正常吗？

解冻添加剂时产生少量沉淀是正常现象，这通常不会影响培养基的效能。顺利获得充分混匀，这些沉淀会重新分散到培养基中，细胞仍然可以在正常的环境下生长。如果您注意到的是少量的细小沉淀颗粒，只需要在使用前摇匀培养基，就可以继续使用而不必担心实验受到影响。

但如果发现培养基中有大量沉淀或沉淀颜色异常，这可能与解冻过程不正确有关。如果是在37℃解冻添加剂就会析出大量沉淀，导致培养基效能下降。解冻时，建议将添加剂放在室温慢慢解冻，然后充分混匀，确保最终的培养基状态良好。如果已经有明显的过量沉淀，那么更换新的培养基可能是更安全的选择。

5. 为什么冷冻iPSC细胞前要清除分化区域?

在冷冻细胞之前清除分化区域，可以帮助保证冷冻后细胞的一致性和质量。分化区域的细胞已经偏离了干细胞的特性，在复苏后可能会进一步影响整个培养体系的稳定性。

顺利获得移液枪头或其他工具小心去除分化区域，可以确保冷冻保存的细胞库中只保留健康的干细胞群体。这样一来，复苏时复活的细胞会更整齐、状态更好，为后续实验给予更可靠的基础。如果不去除分化区域，这些细胞在复苏后可能会加速分化扩散，导致实验数据变异增加甚至实验失败。所以，冷冻前的这一步骤虽然看似简单，但对长期培养稳定性和实验成功率非常重要。

6. 如果iPSC细胞出现分化了怎么办？

分化的处理方法会根据严重程度有所不同。如果只是轻微分化，比如克隆周围有一些分化细胞，可以顺利获得高比例传代（≥1:6）来稀释这些分化区域。这样分化细胞的密度会变低，剩下的干细胞群体就更容易维持健康状态。

如果少量分化细胞仍然存在，可以用细胞刮或者巴斯德管轻轻刮掉。对于克隆内部松散或者边缘不平滑的小范围分化问题，试试陆续在传代两到三次，通常可以恢复正常。但如果分化程度较严重，比如分化区域已经占据大部分克隆，建议直接放弃该批细胞，重新复苏新的一批。这种情况下，花时间调整可能得不偿失。

7. 培养箱的环境需要注意什么？

温度：始终保持在37°C。温度过高会使细胞过早分化，过低会影响生长速度和活性。
CO₂浓度：维持在5%。CO₂是培养基pH平衡的关键因素，浓度不足或过高都会影响细胞状态。
湿度：维持在95%左右。湿度不够时，培养基会蒸发过快，导致浓度变化，进而影响细胞的稳定生长。
定期检查和维护：每天检查培养箱的温度、CO₂浓度和湿度是否稳定。避免频繁开关门，防止环境参数波动。如果发现培养箱参数不稳定，可能是传感器故障或密封不良。应尽快检查并修复，确保环境条件始终恒定。
总之保证培养箱参数长期稳定，才能为细胞给予一个持续可靠的生长环境，减少实验变异和不良结果的发生。